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項目介紹

可檢測任意兩種分子間的相互作用，它可以簡單地通過測量兩個溶液相互作用時吸收或放出的熱量來提供分子相互作用的重要信息，如結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)、自由能、焓和熵。

分子間相互作用過程中價鍵的形成和破壞需要釋放或者吸收能量，絕大部分化學(xué)和生化過程也都伴隨著熱量的吸收和釋放，微量熱檢測的是最基本、最普遍的物理量-熱量變化。儀器靈敏度的提高讓檢測mcal或者ncal水平的熱量成為可能，樣品的用量也隨著儀器設(shè)計的進步而減少到可以接受的程度，ITC 儀能實現(xiàn)微量研究。被分析的樣品始終處于天然的溶液狀態(tài)和構(gòu)象，無需修飾。測試過程非光學(xué)檢測，樣品顏色、內(nèi)在熒光、透明度對實驗沒有影響。熱量測定可以在廣泛的溶液環(huán)境和溫度條件下進行，所以 ITC 儀能對廣泛的樣品進行測試分析。技術(shù)特點：分子量范圍廣、溶液中檢測、無需標(biāo)記、廣泛適用性。

樣品要求

核酸-小分子、生物分子-細胞相互作用、酶促反應(yīng)動力學(xué)等，可以檢測任意兩種小分子之間的結(jié)合力。

要求檢測樣品的純度高，抑制劑等溶劑需提供分子量。樣品濃度越高越好，確保緩沖液、pH、DMSO匹配。

最少樣品量：蛋白2mg，小分子10mM/500ul，蛋白多肽需低溫寄送。

項目案列

點陣圖

熱量圖

常見問題

KD，C-value與反應(yīng)物濃度的選擇

KD=弱結(jié)合，需要更高的配體濃度來飽和結(jié)合位點。低KD=強結(jié)合，只要較低的配體濃度就能飽和結(jié)合位點。因此，KD對選擇合適的反應(yīng)物濃度至關(guān)重要。

如果不清楚KD，可按經(jīng)驗濃度范圍進行準備，樣品池一般為10uM~10mM，滴定針比樣品池濃度一般高10-20倍，建議初始嘗試200uM滴20uM

反應(yīng)物濃度=C-value*KD*N，C-value值一般在10-100之間實驗結(jié)果最好。C-value太低，點陣圖曲線很難達到飽和。C-value太高，點陣圖曲線爆炸式地達到飽和。

為什么ITC要求上下樣品間的緩沖液必須匹配呢？

輕微稀釋放熱會對結(jié)果產(chǎn)生影響。因此，必須使用一致的緩沖液，或者設(shè)置對照實驗來消除背景稀釋放熱對結(jié)果的影響。

滴定間隔時間不足會導(dǎo)致什么樣的結(jié)果呢？

基線不穩(wěn)能反應(yīng)哪些問題？

1.低基線

原因：（1）樣本池填充不夠；（2）弄臟的測量池會使上樣效果不佳；（3）測量池里有氣泡

2. 陡峭尖

原因：（1）測量池里有氣泡；（2）基線尖刺因注射而成卷積狀

3.向上步進式基線

原因：（1）測量池弄臟了；（2）樣本池填充不夠

4.向下步進式基線

原因：（1）測量池里有氣泡；（2）基線尖刺因注射而成卷積狀

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